Манлио Ди Стефано работал IT-консультантом в американской компании, а также был волонтером итальянской НПО, действующей в Демократической Республике Конго и Республике Гватемала в рамках проектов по обеспечению устойчивого развития.

В 2013 году Ди Стефано стал депутатом парламента Италии, где впоследствии большинством голосов однопартийцев назначен лидером партии «Движение 5 звезд» парламентской комиссии по иностранным делам. Манлио Ди Стефано является членом представительства Италии в Совете Европы, исполняет обязанности Председателя Комиссии по делам детей-беженцев, детей-мигрантов и несовершеннолетних мигрантов. На данной должности, Манлио подготовил и представил два результативных доклада об отсутствии гражданства детей мигрантов и о несовершеннолетних мигрантах, прибывающих без взрослого сопровождения. Манлио Ди Стефано является также национальным наблюдателем LEX Parlamento, являющегося одним из основных инструментов, включенных в веб-платформу партии «Движение 5 звезд», носящую название Rousseau, для продвижения европейской демократии. В марте 2018 года Ди Стефано был повторно избран депутатом парламента Италии, вскоре назначен заместителем министра иностранных дел правительства Конте.

Получил образование по специальности «Вычислительная техника».